자연에서 모기를 죽이는 Cry11Aa 및 Cry11Ba 구조에 대한 새로운 결정

Nature Communications 13권, 기사 번호: 4376(2022) 이 기사 인용

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Cry11Aa와 Cry11Ba는 모기약인 Bacillus thuringiensis subsp.에 의해 생성되는 가장 강력한 두 가지 독소입니다. 이스라엘렌시스(Israelensis)와 자가테산(Jegathesan). 독소는 숙주 내에서 자연적으로 결정화됩니다. 그러나 싱크로트론 소스에서 구조를 결정하기에는 결정이 너무 작습니다. 따라서 우리는 이러한 독소의 생체 내 성장 나노 결정에 X 선 자유 전자 레이저의 직렬 펨토초 결정학을 적용했습니다. Cry11Aa의 구조는 단일 파장 변칙 분산 방법을 사용하여 새롭게 결정되었으며, 이를 통해 분자 교체에 의한 Cry11Ba 구조의 결정이 가능해졌습니다. 두 구조는 Cry 독소의 생체 내 결정화에 대한 새로운 패턴을 나타냅니다. 이에 따라 세 도메인 각각은 대칭적으로 동일한 도메인으로 패킹되고 절단 가능한 결정 패킹 모티프는 말단이 아닌 프로톡신 내에 위치합니다. 생체 내 결정화 패턴의 다양성은 다양한 수준의 독성에 대한 설명과 모기 방제를 위해 이러한 독소를 개선하기 위한 합리적인 접근 방식을 제시합니다.

모기 및 검은 파리 벡터 개체군을 통제하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 생물학적 살충제는 Bacillus thuringiensis subsp. 박테리아에 의해 생산됩니다. israelensis(Bti), 1976년 이스라엘에서 발견1. 이 제품은 다양한 벡터의 유충 단계를 대상으로 하며, 높은 효능과 환경 안전성으로 인해 많은 벡터 제어 프로그램에서 광범위한 합성 화학 살충제를 대체했습니다. 여기에는 말라리아를 전파하는 Anopheles gambiae 및 관련 종뿐만 아니라 웨스트 나일 뇌염 및 황열병을 유발하는 바이러스와 같은 바이러스를 전파하는 수많은 Culex 및 Aedes 종이 포함됩니다. Bti 제품은 강변실명증을 유발하는 사상충을 매개하는 검은 파리 종을 규제하기 위해 아프리카에서도 사용됩니다. 벡터 개체군 외에도 독일 라인강 계곡, 프랑스 남부 카마르그, 미국, 아시아, 라틴 아메리카 및 남미 전역에서 지난 30년 동안 수천 톤의 모기를 방제하는 데 사용되었습니다.

Bti의 매우 강력한 모기 박멸 활성은 4가지 프로톡신의 3가지 나노결정질 형태에 기인합니다. Cyt1Aa, Cry11Aa 및 공동 결정화된 Cry4Aa 및 Cry4Ba. 이들은 포자 형성 중에 생성되며 다양한 조건에서 매우 안정적이지만 모기 유충의 중장2 특유의 높은 알칼리성 pH 수준에서 섭취 후에는 용해됩니다. 용해된 프로톡신은 곤충 장내 프로테아제에 의해 활성화되어 장 세포막에 결합하고, 후속 올리고머화를 거쳐 궁극적으로 장 세포 용해를 통해 유충의 죽음을 초래합니다2. Bti 독소는 광범위한 화학 살유충제보다 대상 모기에 훨씬 더 특이적이기 때문에 환경적으로 안전합니다.

4가지 Bti 독소 중 가장 강력한 것은 Cry11Aa이지만 Cry4Aa, Cry4Ba 및 Cyt1Aa와는 달리 구조가 알려져 있지 않기 때문에 그 활성화 및 독성 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. Bt subsp.가 생산하는 관련 독소입니다. jegathesan(Btj)은 Cry11Ba로 Aedes, Anopheles 및 Culex3 속에 속하는 주요 모기 벡터 종에 대해 Cry11Aa보다 7~37배 더 독성이 있으며 일부 박테리아 숙주에서는 약간 더 큰 결정을 형성하는 것으로 보입니다. Cry11Ba의 구조도 알려져 있지 않지만 모기 박멸 활성을 크게 향상시키기 위해 Bti의 재조합 균주에서 Cry11Aa를 대체하는 데 사용되었습니다3,4. 따라서 우리의 목표는 Cry11Aa 및 Cry11Ba 프로톡신의 구조를 결정하여 알칼리성 pH에서만 불안정한 견고한 결정의 형성을 어떻게 달성하는지 이해하고 모기 방제를 위한 이러한 단백질의 효능을 높이기 위한 구조적 통찰력을 얻는 것이었습니다.

천연 나노결정에서 Cry11Aa 및 Cry11Ba 프로톡신의 구조를 결정하려면 최첨단 기술이 필요합니다. 기존의 결정학은 결정이 싱크로트론 X선 빔에서 개별적으로 장착되고 진동할 만큼 충분히 큰 프로젝트로 제한됩니다. 과거에는 활성화된 Cry4Aa5, Cry4Ba6 및 Cyt1Aa7의 결정이 천연 나노결정에서 용해된 독소로부터 시험관 내에서 성장하고 독소를 효소적으로 활성화함으로써 충분한 크기를 얻었습니다. 그러나 Cry11Aa 및 Cry11Ba는 용해된 나노결정으로부터 시험관 내에서 재결정화되지 않습니다8. 더욱이, 우리의 목표는 자연 결정 용해의 pH 제어 메커니즘을 이해하는 것이기 때문에 효소 활성화는 바람직하지 않습니다. 박테리아 세포에서 생성된 천연 나노결정의 프로톡신 상태를 관찰하기 위해 XFEL(X선 자유 전자 레이저)9,10,11에 직렬 펨토초 결정학(SFX)을 적용했습니다. SFX 실험에서 각각 ~10-50fs만 지속되는 고광도 XFEL 빔 펄스는 일련의 나노 결정을 가로채서 결정당 하나의 펄스로 각 작은 결정이 기화되기 전에 가능한 가장 강한 회절 신호를 유도하고 생성합니다. 일련의 회절 스냅샷은 나중에 전체 데이터 세트로 수집됩니다. 이 전략의 타당성은 최근 Cyt1Aa12의 전체 생체 활성화 캐스케이드에 대한 해명을 통해 입증되었습니다.

3 residues) between α3 and α4 (−5 and −8 residues with respect to Btk Cry2Aa and Btt Cry3Aa), and β20 and β21 (−10 and −9 residues with respect to Btk Cry2Aa and Btt Cry3Aa). Altogether, these changes render Cry11 toxins uniquely large from the structural standpoint, with predicted radii of gyration of 27.5 and 26.7 Å for Cry11Aa and Cry11Ba, compared to 25.0 and 25.6 Å for Btk Cry2Aa and Btt Cry3Aa, respectively./p>370,000 patterns (native and three derivatives) collected on crystals with ~100,000 unit cell28. Our success in phasing the Cry11Aa structure likely stemmed from a combination of the use of a dramatically powerful phasing agent16,17 and advances in SFX data processing tools over the last five years, including the Xgandalf56 indexing algorithm and improvements in data handling and integration in CrystFEL57. It should offer hope to investigators seeking to determine the structure of proteins of which no known structural homologue exists and that have to resort to SFX due to smallness of their crystals. It is foreseeable, however, that de novo structure determination will be helped by recent advances in comparative and ab initio modelling and the availability of programs such as RosettaFold58 and AlphaFold259, capable of producing a decently-accurate structure for virtually all proteins and thus a good model for phasing of crystallographic data by molecular replacement. Latest releases of the two programs were published in the final stage of the writing of this manuscript, hence we asked whether or not the availability of these tools would have facilitated our journey towards the Cry11 toxins structures, and submitted the sequence of Cry11Aa to the two servers. For RosettaFold, the r.m.s.d. to the final refined structure of the five best models was over 4 Å, with discrepancies observed mostly in domain II. For AlphaFold2, however, the two first models displayed r.m.s.d. of 1.2 and 1.0 Å to the final structure, respectively. Using the worst of these two models, we could find a molecular replacement solution using Phaser, and a partial model featuring 95% of the residues in sequence was obtained after 20 cycles of automatic iterative model-building and refinement using Bucanneer60 and Refmac561. Thus, a problem which occupied five crystallographers for several years could have been solved in less than an hour using the new tools recently made available to the structural biology community. Based on our results, it is tantalizing to claim that the phase problem in crystallography has been solved, or that experimental structural biology will be abandoned, but such assertions would likely be shortsighted. Rather, we encourage investigators to challenge AlphaFold2 and RosettaFold as much as humanly possible, but to not forsake de novo phasing as it may remain the only route to success in difficult cases where molecular replacement based on such models does not work62. It must also be emphasized that in the case of Cry11 toxins and, more generally, naturally-crystalline proteins, the issue is not just phasing, but packing. For such proteins, crystal formation and dissolution serve function, hence characterization of packing interfaces is central to finely comprehend their bioactivation cascades. Without the naturally-occurring crystals and the atomic resolution experimental SFX data, it would not have been possible to make predictions on potential mutations affecting Cry11Aa crystal formation or dissolution./p>